一种猪胎盘素的分离提取方法，属于保健食品的研制与开发领域。本发明以猪胎盘为原料，经高速组织匀浆，低温低频超声波辅助提取，再经高速冷冻离心得到粗提液，可溶性蛋白类含量2～4mg/mL，再通过10KDa超滤膜超滤获得低分子量的猪胎盘素液，其中的多肽含量600～1000μg/mL，再经过微波真空冷冻干燥得到固体猪胎盘素产品。本发明所得的猪胎盘素具有营养保健功能；采用低频超声波（28-45kHz）辅助提取，与无超声波辅助的提取率相比高出10%～15%；采用微波真空冷冻干燥工艺，与普通真空冷冻干燥相比干燥时间缩短30%～40%，同时保证猪胎盘素的营养价值损失少，提高了猪胎盘素的分离提取效率。
1.一种猪胎盘素的分离提取方法，其特征在于以猪胎盘为原料，原料经高速组织匀浆，采用低温低频超声波辅助提取技术，经高速冷冻离心得到粗提液，再通过10KDa超滤膜超滤获得含有低分子量的猪胎盘素溶液，再经过快速预冻、微波真空冷冻干燥得到固体猪胎盘素产品；步骤为：（1）猪胎盘原料的处理：自然分娩，免疫学检测合格的猪胎盘，经冷藏运输，清水清洗表面无血渍及其他杂物，去除血管和筋膜，分割成2cm×2cm小块，清水再次清洗至无血渍，于-65℃下快速冻结，冷冻待用；（2）猪胎盘高速组织匀浆液的制备：取超低温冷冻的猪胎盘原料，室温下解冻，剪碎大小为0.5cm×0.5cm，再次清洗至无血渍，以猪胎盘原料︰去离子水w/w料液比2︰1～2︰5，在10000rpm组织匀浆机中匀浆至匀浆液呈自然流动状态，并在匀浆过程中保持匀浆液温度不超过40℃；（3）低温低频超声波辅助提取：匀浆液加入一定量的去离子水，最终形成猪胎盘原料︰去离子水w/w料液比1︰10～1︰30的混合液；采用探头式超声波处理装置，超声探头为15cm，探头浸入处理溶液深度1.5cm，处理量为80mL，设定超声功率200~350w，频率28-45Hz，超声时间4~10min，提取温度40～60℃，提取率比无超声波处理提高10%-15%，超声处理之后迅速置于4℃冰箱中降温；（4）高速冷冻离心：4℃下，8000g离心30min，取上清液，即粗提液，其中的可溶性蛋白类含量2～4mg/mL；（5）10KDa超滤膜超滤：取离心上清液，经10KDa离心超滤管，以2000～3000rpm转速下，离心超滤40～70min，获得含有低分子量的猪胎盘素溶液；20%磺基水杨酸测定蛋白反应呈阴性，表明不存在大分子蛋白，猪胎盘素溶液呈外观透明，略带腥味，最大吸收波长220±1nm，pH6.96±0.3，多肽含量600～1000μg/mL；（6）快速预冻：猪胎盘素溶液置于样品盘中，厚度0.5～1cm，采用快速风冷装置在8～18min内迅速冻结到-30～-40℃，使得冻结样内部均匀呈现细小颗粒；（7）微波真空冷冻干燥：将冻结的样品，置于微波真空冷冻干燥机加热板上，抽真空使真空度达到100~200Pa，冷井温度-35～-40℃，加热板上控制物料温度，通过2450Hz微波加热保持在30～40℃，功率为1.5～3w/g物料，持续干燥5～9h，最终产品水分含量低于6%，呈白色粉末，即为固体猪胎盘素产品。技术领域
xa0xa0xa0xa0一种猪胎盘素的分离提取方法，该方法是以猪胎盘为原料，经高速组织匀浆，低温低频超声波辅助提取，高速冷冻离心和10KDa超滤膜超滤，获得低分子量的猪胎盘素溶液，再经过微波真空冷冻干燥得到固体猪胎盘素产品，涉及到低温超声波提取工艺和微波真空冷冻干燥工艺，属于保健食品的研制与开发领域。
背景技术
xa0xa0xa0xa0猪胎盘素是指采用生物技术（低温萃取，冷冻技术等），经过细胞破碎，低温溶解浸提，超滤、透析等步骤纯化，或再经过冷冻干燥后得到的小分子多肽物质，是一种纯天然的提取物。它含有多种人体必需氨基酸、抗体、干扰素及促细胞生成素等，具有提高机体免疫力等作用。猪胎盘与人、羊及鹿胎盘等属于同一类资源，大量的研究表明人、羊及鹿的胎盘素具有良好的营养价值。陈灵（1999年）等提取出猪胎盘中的转移因子，研究其性质及进行小鼠试验，证明提取物能有效提高机体免疫力和抗疲劳、抗疾病能力。周国华（2006年）以超滤法从羊和猪胎盘中提取出了胎盘肽，以MTT比色法研究二者的功效，效果均为明显。徐红（2006）对比紫河车与猪胎盘对人体的催乳作用，认为猪胎盘与紫河车具有相似的药理作用。Arijitaxa0Jash（2011年）等研究了猪胎盘提取物对接触性过敏反应的缓解抑制作用，证明其有减缓过敏反应的效果。Eunxa0Juxa0Lee（2012年）研究了猪胎盘中胆固醇提取物对肌原性细胞增值、细胞分化及脂肪积累作用，发现其具是诱导脂肪沉积的无毒物质，有促进细胞分化作用。余宙（2010年）以95℃水提取人胎盘和猪胎盘，小鼠试验对比发现在抗老年痴呆方面两者无统计学上的差异。上述研究表明猪胎盘素是一种具有良好生物活性的物质，是值得开发利用的新资源。坊间的加工手段常为炮制，烘干磨粉等。由于加工工艺中采用高温煮制和高温的烘烤导致了猪胎盘中热敏性营养成分的极大损失，蛋白质等物质的变性失活。目前，对与猪胎盘素的有效分离提取的研究较少。超声波是一种频率高于20kHz，不能够引起听觉的弹性波，其主要通过空化效应、热效应和机械作用来实现加速加工过程。在食品行业，超声波辅助能极大的提高很多的加工过程，能够在几秒或者几分钟的时间里实现加工目的，具有高重复性、低加工成本、易操作、易扩大化生产和加工的产品纯度高的特点。因此，广泛应用在食品加工、保藏和提取领域当中，如烹调、冻结、除气、除沫、干燥、乳化、卤制、切割、杀菌等。尤其超声波辅助提取技术，具有高效传质、选择性提取、降低提取温度的作用，且易于控制超声辅助提取过程，是非常适合于热敏性高营养价值的物质的提取。对于蛋白类提取而言超声波可极大的提高提取率。在超声波应用方面，张慜等（200710134436.X，ZLxa0201110373505.9，ZLxa0201210537889.8，201310149847.1，）应用超声波技术在果蔬和艾草速冻和解冻品质控制、调理油炸豌豆品质调整和调理胶质水产品预处理三个方面，结果表明超声波的应用能够缩短豌豆的油炸时间和提高产品品质，而在果蔬和植物类物料的速冻与解冻的应用也能够达到缩短速冻和解冻时间的效果，因此提高了物料加工后的品质，超声波预处理之后再进行干燥，能够提高干燥的速度并具有良好的复水性质。在蛋白类提取方面，Jianfeixa0Zhu等（2012）利用超声波辅助提取紫苏籽蛋白，经过工艺参数的优化最终的提取物中蛋白含量达到了10.77%，而Kexuexa0Zhu（2009）应用超声波与反向萃取脱脂小麦胚芽蛋白，其提取率高达45.6%。Bishnuxa0Karki等（2010）通过超声波强化脱脂大豆片中的蛋白和糖类物质的释放，研究表明其最高的糖类释放率在50%，而蛋白提取率在46%。总结研究报道发现，应用超声波辅助提取的物质与应用传统的工艺或微波辅助提取工艺提取的物质，在物质结构、生物活性的保持方面基本没有差别。在化工、食品、医药、木材、矿业等行业中都有应用到各类干燥技术，各类干燥设备众多。而公认的最适合于具有生物活性原料的干燥技术则是真空冷冻干燥技术，与其他干燥技术不同的是，真空冷冻干燥是在高真空条件下，将原料中冻结的冰晶，直接由固态升华为气态，原料在很低的温度完成了干燥过程，因此对原料所具有的生物活性和营养价值损失非常少。然而真空冷冻干燥技术还具有干燥时间长的缺点，对于不同的原料，由于它们的共晶点不同，故需要摸索不同原料的共晶点，再采取合适的真空冷冻干燥工艺，实现高效高质量的干燥。而微波真空冷冻干燥采用微波为加热源，利用微波的内部加热特性更进一步的提高干燥效率，缩短干燥时间。Xuxa0Duan（2010）等研究了海参的微波冷冻干燥表明微波辅助冷冻干燥能有效的缩短冷冻干燥的时间。张慜等（ZLxa0200710134872.7）结合纳米银涂膜与微波冷冻干燥，发现其能有效的保持产品的品质且具有良好的杀菌作用。xa0xa0xa0xa0在猪胎盘素制备工艺研究方面，黄明（200510011547.2）将猪胎盘破碎后加入保护剂，进行低温高压均浆处理，离心后去上清，真空冷冻干燥后得到猪胎盘素。与该发明采用低温高压均浆处理不同的是本发明采用低频超声波提取技术，很好的提高了猪胎盘素的提取效率，也缩短了提取时间。郝文华（200610146066.7）采用pH2.1～2.9的酸处理液反复处理3次，中性水清洗，除去酸后，在12℃～15℃下，经100天分散的胎盘组织液，用高速涡旋超声波细胞裂解器裂解细胞，应用反渗透过滤装置过滤处理裂解液，再加入赋形剂及乳化剂，得到兽用复方氨基酸口服液。该报道中对猪胎盘原料的处理采用了酸处理过程，而且分散工艺过程时间很长，本发明低频超声波的应用提高了提取效率的同时，也避免了酸处理对猪胎盘素可能造成的生物活性损害。常功等（200910064789.6）利用猪胎盘中各种物质具有的不同的结构、分子量、等电点、理化特性、生物活性等，采用盐溶、盐析、层析、超滤等技术，可生产出多种功效成份：免疫球蛋白、免疫活性肽、超氧化物歧化酶、脂多糖、胎盘蛋白。与该研究不同的是本发明简化了猪胎盘素的提取工艺，采用简单易行的低频超声波处理和超滤工艺，能很好的提取其中的关键活性成分，具有提取率高和缩短提取时间的优点。康建南（201010144651.X，专利题目：一种猪胎盘素制备工艺）经121℃，蒸汽灭菌30min预处理，氢氧化钠或碳酸钠调节pH，加热至45℃～65℃，采用胰酶消化、三氯乙酸去蛋白、醇沉纯化得到了猪胎盘脂多糖精品，称之为猪胎盘素。该发明以提取的猪胎盘脂多糖作为猪胎盘素，而本发明主要以提取的多肽作为猪胎盘素的主要活性物质，并且201010144651.X发明中采用了高温高压的灭菌过程，容易造成猪胎盘素的生物活性的失效。而本发明整个提取过程都在较低的温度下进行，具有良好的保持猪胎盘素生物活性的优点。王会强（200910157839.5）以盐酸进行酸水解，再加蛋白酶4~6小时，在80℃～95℃下灭酶，再以碱调节pH，活性炭吸附上清，300μm以上过滤得到滤液，可制成胶囊、片剂、丸剂等。其工艺过程采用盐酸水解再酶解的工艺过程，充分的利用了胎盘原料中的蛋白质资源，但是得到的产品并非是胎盘中天然存在的物质，而本发明对猪胎盘素的提取都是胎盘中本身存在的物质，保持了其物质结构组成。在胎盘素提取工艺方面，乌云（2005）研究报道了羊胎盘素的新法提取工艺，羊胎盘在经过匀浆后，高速离心得到上清液，按1︰1.3～1.5的比例加入有机溶剂后沉淀出大分子物质，离心后对上清进行减压浓缩，得到微黄色透明液体，即羊胎盘素。张寿（200810231872.3）对高原牦牛胎盘进行60℃～80℃的热风干燥后，粉碎研磨过50～80目，得到米黄色胎盘素保健品。与以上两种提取方法相比较而言，本法明采用超声辅助提取技术和超滤技术得到具有高生活活性的胎盘素（小分子物质），再进行高效的微波真空冷冻干燥，明显不同于该发明所述内容，并且发明中未使用到有机溶剂。陈包容（200710107913.3和200710107912.9）将胎盘经过冷冻干燥后，进行二氧化碳的超临界萃取，然后再经过多级的分离得到胎盘素溶液，冷冻干燥胎盘素溶液后得到干燥胎盘素。另一发明中还有酶解技术水解超临界萃取物，得到6000Da以下的酶解肽，再进行冷冻干燥得到胎盘组织冻干粉。与该发明不同的是本发明采用的是具有工业化前景和加工提取投入成本少的超声波辅助提取技术，并且采用的微波真空冷冻干燥可以明显的缩短干燥所需的时间，本发明中未采用酶解技术主要是为了保证提取物的天然性。姜雪琪（201110193938.6和201110193930.X）采用低温条件下的超微粉碎的方法对羊胎盘进行细胞破碎，先提取其中的有效成分，即羊胎盘素，然后对沉淀物进行酶解处理，得到酶解肽，混合二者得到最终产品，即羊胎盘素原液，最后采用葡聚糖凝胶精制出各分子量的物质。而本发明采用低频超声波进行细胞的破碎，在一定条件下能够很好的提高细胞破碎程度，而且低频超声波具有易于操作和容易实现工业化大量处理的特点。然而，以上对猪胎盘素的分离提取加工或多或少的利用到了高温、高浓的盐处理、强酸处理、强碱处理，容易造成猪胎盘素的生物活性的丢失，而且加工步骤和时间都比较长。本发明，以健康猪胎盘为原料，主要通过应用低温低频超声波技术、低分子量超滤技术和高效的微波真空冷冻干燥技术，不但保证了猪胎盘素的生物活性，而且提高了分离提取的效率。
发明内容
本发明的目的是提供一种猪胎盘素的分离提取方法，以健康的猪胎盘为原料，分离提取其中的小分子营养功能性成分，涉及到低温低频超声波辅助提取技术、超滤技术和微波真空冷冻干燥技术，这些技术的应用既保证了猪胎盘素的高提取率又减少了加工过程对猪胎盘素营养价值的损失，扩大了新技术在食品营养成分的分离提取的应用范畴。本发明的技术方案：一种猪胎盘素的分离提取方法，以猪胎盘为原料，原料经高速组织匀浆，采用低温低频超声波辅助提取技术，经高速冷冻离心得到粗提液，再通过10KDa超滤膜超滤获得含有低分子量的猪胎盘素溶液，再经过快速预冻、微波真空冷冻干燥得到固体猪胎盘素产品；步骤为：（1）猪胎盘原料的处理：自然分娩，免疫学检测合格的猪胎盘，经冷藏运输，清水清洗表面无血渍等其他杂物，去除血管和筋膜，分割成2cm×2cm小块，清水再次清洗至无血渍，于-65℃下快速冻结，冷冻样品待用。（2）猪胎盘高速组织匀浆液的制备：取超低温冷冻的猪胎盘原料，室温下解冻，剪碎大小为0.5cm×0.5cm，再次清洗至无血渍。以料液比（猪胎盘原料︰去离子水w/w）2︰1～2︰5，在10000rpm组织匀浆机中匀浆至匀浆液呈自然流动状态，并在匀浆过程中保持匀浆液温度不超过40℃。（3）低温低频超声波辅助提取：匀浆液加入一定量的去离子水，最终形成料液比（猪胎盘原料︰去离子水w/w）1︰10～1︰30的混合液。采用探头式超声波处理装置，超声探头为15cm，探头浸入处理溶液深度约1.5cm，处理量为80mL。设定超声功率200~350w，频率28-45Hz，超声时间4~10min，提取温度40～60℃。提取率比无超声波处理提高10%-15%。超声处理之后迅速置于4℃冰箱中降温。（4）高速冷冻离心：4℃下，8000g离心30min，取上清液，即粗提液，其中的可溶性蛋白类含量2～4mg/mL。（5）10KDa超滤膜超滤：取离心上清液，经10KDa离心超滤管，以2000～3000rpm转速下，离心超滤40min～70min，获得含有低分子量的猪胎盘素溶液。20%磺基水杨酸测定蛋白反应呈阴性，表明不存在大分子蛋白。猪胎盘素溶液呈外观透明，略带腥味，最大吸收波长220±1nm，pH6.96±0.3，多肽含量600～1000μg/mL。（6）快速预冻：猪胎盘素溶液置于样品盘中，厚度0.5～1cm，采用快速风冷装置在8～18min内迅速冻结到-30～-40℃，使得冻结样内部均匀呈现细小颗粒。（7）微波真空冷冻干燥：将冻结的样品，置于微波真空冷冻干燥机加热板上，抽真空使真空度达到100~200Pa，冷井温度-35～-40℃，加热板上控制物料温度，通过2450Hz微波加热保持在30～40℃，功率为1.5～3w/g物料。持续干燥5～9h，最终产品水分含量在低于6%，呈白色粉末，即为固体猪胎盘素产品。所述猪胎盘素的分离提取方法，在于分离提取其分子量范围在4000～8000Da小分子量的营养成分。本发明的有益效果：与传统的分离提取猪胎盘素相比，本发明采用了低温低频超声波辅助提取技术，它能够在短时间内将猪胎盘素从猪胎盘原料中溶解释放出来，而且具有很高的提取效率、生物安全性和重复性。采用的高效微波真空冷冻干燥技术，比传统的真空冷冻干燥技术缩短了干燥时间，而且产品很好的保持了其特有的生物活性和营养价值。采用低频超声波（28-45kHz）辅助提取，与无超声波辅助的提取率高出10%～15%；采用微波真空冷冻干燥工艺，与普通真空冷冻干燥相比干燥时间缩短30%～40%，同时保证猪胎盘素的营养价值损失少，提高了猪胎盘素的分离提取效率。
具体实施方式
实施例1：猪胎盘素的28kHz低频超声波辅助高效分离提取取自然分娩，免疫学检测合格的猪胎盘，用清水清洗表面无血渍等其他杂物之后，去除血管和筋膜，分割成2cm×2cm小块，再次用清水清洗至表面无血渍，置于超低温冰箱中-65℃下冻结，待用。使用时，取冷冻的猪胎盘原料，室温下解冻，用剪刀剪碎为大小0.5cm×0.5cm，再次清洗至无血渍。调整料液比（猪胎盘原料︰去离子水w/w）为2︰4，在10000rpm组织匀浆机中匀浆至匀浆液呈自然流动状态，并在匀浆过程中保持匀浆液温度不超过40℃。将匀浆液加入一定量的去离子水，最终形成料液比（猪胎盘原料︰去离子水w/w）1︰12的混合液。在探头式28kHz低频超声波处理装置中，超声探头为15cm，探头浸入处理溶液深度约1.5cm，处理量为80mL。设定超声功率200w，超声时间10min，提取温度45℃。超声处理之后迅速置于4℃冰箱中降温。将处理的混合液置于50mL的离心管中，于4℃下，8000g离心30min，取上清液，即粗提液，其中的可溶性蛋白类含量2.5～3mg/mL。然后取离心上清液，经10KDa离心超滤管，以3000rpm转速下，离心超滤40min，得到含有猪胎盘素的超滤液。20%磺基水杨酸测定蛋白反应呈阴性，表明不存在大分子蛋白。猪胎盘素溶液呈外观透明，略带腥味，最大吸收波长220±1nm，pH6.98，多肽含量800～1000μg/mL。猪胎盘素提取液置于样品盘中，厚度约0.5cm，采用快速风冷装置在8min内迅速冻结到-35℃，使得冻结样内部均匀呈现细小颗粒。再将冻结的样品，置于微波真空冷冻干燥机加热板上，抽真空使真空度达到150Pa，冷井温度-40℃，微波功率2w/g物料，加热板温度控制在30℃，持续干燥8h，最终产品水分含量低于6%，呈白色粉末，得固体猪胎盘素产品。xa0xa0xa0xa0采用28kHz低频超声波辅助提取，与无超声波辅助相比，提取率高出12%；采用微波真空冷冻干燥工艺，与普通真空冷冻干燥相比干燥时间缩短32%，同时保证猪胎盘素的营养价值损失小于10%，提高了猪胎盘素的分离提取效率。实施例2：猪胎盘素的45kHz低频超声波辅助高效分离提取取自然分娩，免疫学检测合格的猪胎盘，用清水清洗表面无血渍等其他杂物之后，去除血管和筋膜，分割成2cm×2cm小块，再次用清水清洗至表面无血渍，置于超低温冰箱中-65℃下冻结，待用。使用时，取冷冻的猪胎盘原料，室温下解冻，用剪刀剪碎为大小0.5cm×0.5cm，再次清洗至无血渍。调整料液比（猪胎盘原料︰去离子水w/w）为2︰5，在10000rpm组织匀浆机中匀浆至匀浆液呈自然流动状态，并在匀浆过程中保持匀浆液温度不超过40℃。将匀浆液加入一定量的去离子水，最终形成料液比（猪胎盘原料︰去离子水w/w）1︰18的混合液。在探头式45kHz低频超声波处理装置中，超声探头为15cm，探头浸入处理溶液深度约1.5cm，处理量为80mL。设定超声功率270w，超声时间7min，提取温度50℃。超声处理之后迅速置于4℃冰箱中降温。将处理的混合液置于50mL的离心管中，于4℃下，8000g离心30min，取上清液，即粗提液，其中的可溶性蛋白类含量2～2.7mg/mL。然后取离心上清液，经10KDa离心超滤管，以2000rpm转速下，离心超滤60min，得到含有猪胎盘素的超滤液。20%磺基水杨酸测定蛋白反应呈阴性，表明不存在大分子蛋白。猪胎盘素溶液呈外观透明，略带腥味，最大吸收波长220±1nm，pH6.95，多肽含量600～900μg/mL。猪胎盘素提取液置于样品盘中，厚度约0.5cm，采用快速风冷装置在10min内迅速冻结到-38℃，使得冻结样内部均匀呈现细小颗粒。再将冻结的样品，置于微波真空冷冻干燥机加热板上，抽真空使真空度达到120Pa，冷井温度-40℃，微波功率2.5w/g物料，加热板温度控制在35℃，持续干燥6h，最终产品水分含量在低于6%，呈白色粉末，得固体猪胎盘素产品。xa0xa0xa0xa0采用45kHz低频超声波辅助提取，与无超声波辅助相比，提取率高出15%；采用微波真空冷冻干燥工艺，与普通真空冷冻干燥相比干燥时间缩短38%，同时保证猪胎盘素的营养价值损失小于8%，提高了猪胎盘素的分离提取效率。